一株具有调节肠道菌群功能的植物乳杆菌360及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一株具有调节肠道菌群功能的植物乳杆菌360及应用。

背景技术

[0002]   人体胃肠道中存在的百万亿个微生物(大多数是细菌，但也有病毒、真菌和原生动物) ，统称为肠道菌群。大量来自动物模型和人体的研究表明，肠道菌群在人类健康的许多方面发挥着重要作用，包括肠道菌群与肥胖、糖尿病等代谢性疾病症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)、类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis ,RA)、功能性便秘和肠易激综合症(Irritable bowel syndrome，IBS)等疾病的发生发展密切相关(Li D ,Gao C ,Zhang F ,et al .Seven facts and five initiatives for gut microbiome research .Protein Cell .06 2020；11(6):391400)。此外，肠道菌群通过产生维生素和发酵人体自身无法消化的食物成分而有助于个体营养和能量的获取。

[0003] 在健康的情况下，肠道菌群系统处于动态平衡状态。各菌属按照适当的比例生长繁衍，相互依存，相互制约。当机体所处内外环境发生改变，会影响菌群的稳态从而导致菌群失调(Dysbiosis) ，它代表着肠道微生物组成分和功能性的改变、失衡，就会有各种疾病的产生，因此肠道菌群系统处于动态平衡状态对个体的健康具有重要的意义。

[0004] 现阶段调节肠道菌群功能的主要方法有化学药物、粪便菌群移植(FMT) 、益生菌

(Probiotics)、益生元(Prebiotic)和饮食的补充等。粪便菌群移植是将健康人粪便中的菌群移植到患者胃肠道内，以重建具有正常功能的肠道菌群。由于移植他人粪便具有一定的风险性，如传播供者体内的病毒、致病菌等，便秘患者的粪便菌群移植的研究也受到了很大的局限。通过饮食和益生元的调节可以对肠道微生物和相关生理功能产生明显影响，但这种影响不是永久的。如果饮食习惯恢复，肠道微生物和相关生理功能也会稳定回复到干预前的状态。益生菌是指对宿主有利无害的活菌群或死菌，可以是单一菌株制成，也可以是多种菌的复合制剂。益生菌干预作为靶向调节肠道菌群的最直接的手段之一，其研究和应用也受到行业界越来越广泛的关注(Wargo JA .Modulating gut microbes .Science .092020；369(6509):13021303)。

[0005] 植物乳杆菌作为益生菌的一种，可改善肠粘膜屏障、调节肠道菌群，减少肠道细菌移位、抑制病原微生物、改善肠道粘膜免疫和炎症，但是现有的菌株仍存在改善菌群失调不佳的问题，因此开发具有靶向调节肠道功能较好的菌株显得十分重要。

发明内容

[0006]   本发明的目的之一在于，提供一株具有调节肠道菌群功能的植物乳杆菌360，其生物活性高，益生特性强，能调节肠道菌群。

[0007] 本发明的目的之二在于，提供该植物乳杆菌360的应用。

[0008] 本发明的目的之三在于，提供一种包含该植物乳杆菌360的组合物。

[0009] 本发明采用的技术方案如下：

[0010] 本发明提供的具有调节肠道菌群功能的植物乳杆菌3 6 0 L a c t o ba c i l l u s plantarum 360于2015年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC NO：M2015345，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心。

[0011] 本发明的植物乳杆菌360由成都新都农家酸藠头分离纯化得到。

[0012] 本发明的植物乳杆菌360在MRS琼脂培养基上生长良好，菌落呈圆形、菌落大小中等、乳白色、向上凸起、菌落边缘较为整、湿润。革兰氏染色后呈阳性。

[0013] 本发明的植物乳杆菌360经四川省微生物资源平台菌种保藏中心进行16S rRNA鉴定。将测得的1 6 S r R N A 序列进行N C B I B L A S T比对，与G e n e b a n k 中的植物乳杆菌( L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 相似度9 9 ％ ，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株的16S rRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1 所示。

[0030] 本发明的提供的一种药物组合物，包括植物乳杆菌360以及药学上可接受的载体。

[0031] 本发明中所述的“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

[0032] 本发明中，调节肠道菌群是指增加肠道微生物中益生菌丰度和/或降低肠道微生物中致病菌丰度。

[0033] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0034] 本发明的植物乳杆菌360生长快、产酸能力强、耐胃酸、耐胆盐、具有降解亚硝酸盐、抑制病原菌等益生特性。采用本发明的植物乳杆菌360后，肠道微生物中益生菌明显增加，如肠道肠杆菌、乳球菌、双歧杆菌增加；肠道中致病菌减少或不增加，如产气荚膜梭菌减少或不增加。本发明植物乳杆菌360是一种生物活性高，益生特性强的调节肠道菌群的植物乳杆菌。本发明的植物乳杆菌360 活菌制剂具有良好的应用前景。

病菌克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、变异链球菌和产气荚膜梭菌具有较好的抑制效果。

种量接种到MRS液体培养基中，置于恒温培养箱中 37℃静置培养15h；将培养好的植物乳杆菌360菌液采用5000rpm离心10min 收集菌体，并用无菌生理盐水将菌体震荡均匀；按10％ 的添加量将震荡均匀的菌液加入到pH分别为3 .0、3 .5、4 .0、5 .0和6 .0的无菌生理盐水中，以pH6 .0 无菌生理盐水作为对照，37℃恒温培养箱中孵育2h；将孵育后的菌液取出，立即按照

10倍稀释加入灭菌的生理盐水，拍打混匀后检测植物乳杆菌360菌数，对检测的活菌进行统计，并计算存活率，菌株存活率＝试验组/对照组×100％。               [0081] 试验结果如附图7所示，结果表明，植物乳杆菌360在pH4 .0和pH3 .5时的存活率分别为89 .88％ 和88 .69％ ，均较高。本发明的植物乳杆菌360 在pH3 .0时的存活率仍有50 .60％。一般在进食以后，胃液的pH在3 .5左右，说明在进食以后服用的植物乳杆菌360能够耐受胃酸。

[0082] 对胆盐的耐受性

[0083] 将植物乳杆菌360菌株按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次；将活化好的植物乳杆菌360菌液按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，恒温培养箱中37℃静置培养15h；将培养好的菌液采用5000rpm离心10min收集菌体，并用无菌生理盐水将菌体震荡均匀。按10％的添加量将震荡均匀的菌液加入到胆盐浓度分别为1 .0g/L、2 .0g/L、3 .0 g/L和0 .0g/L(对照组)的MRS培养基中，37℃恒温培养箱中孵育3h；将孵育后的菌液取出，立即按照10倍稀释加入无菌生理盐水，拍打混匀后检测植物乳杆菌360菌数；对检测的活菌进行统计，并计算存活率，菌株存活率＝试验组/对照×100％。

[0084] 植物乳杆菌360菌株胆盐耐受性数据如附图8所示。实验结果表明：当胆盐浓度为1 .0g/L和2 .0g/L时，菌株的存活率分别为98 .33％和84 .17％；当胆盐浓度达到3 .0g/L时，菌株存活率仍高达81 .67％。肠道内的胆盐浓度一般在0 .3～3 .0g/L 之间，说明本发明的植物乳杆菌360菌株能够耐受肠道内的胆盐。

[0085] 实施例7

[0086] 本实施例公开了植物乳杆菌360对亚硝酸盐降解性能的试验。

[0087]   将植物乳杆菌360菌株菌种按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次；将活化好的菌液按5％的接种量接种到含有亚硝酸钠的MRS液体培养基中，恒温培养箱中37℃静置培养，每隔3小时取样测定亚硝酸钠含量(亚硝酸钠测定参照GB 5009 .332016)。

[0088] 植物乳杆菌360对亚硝酸钠降解数据见表1。从表中可以看出，植物乳杆菌 360菌株能够迅速降解亚硝酸盐，3小时就能够将30mg/kg的亚硝酸钠降解至小于1mg/kg，这说明植物乳杆菌360菌株具有优良的亚硝酸盐降解性能，在胃肠道具备降解体内的亚硝酸盐的能力。

[0089] 表1植物乳杆菌360菌株亚硝酸钠降解实验数据

[0090]

[0091] 实施例8

[0092] 本实施例公开了植物乳杆菌360对肠道菌群影响试验。

[0093] 1 .试剂：伊红美蓝琼脂(肠杆菌) ；叠氮钠－结晶紫－七叶苷琼脂(肠球菌) ；Lbs琼脂(乳杆菌) ；BBL琼脂(双歧杆菌) ；TSC琼脂(产气荚膜梭菌)均购自北京路桥技术股份有限公司。厌氧袋、厌氧产气袋，均购自日本三菱瓦斯化学株式会社。受试样品为四川高福记生物科技有限公司植物乳杆菌360菌粉(型号：GFJ0301Y，批号：20150710)。

[0094] 2 .动物：KM小鼠，1822g，由四川省中医药科学院动物中心提供(SPF级)。

[0095] 3 .SPF级实验动物环境：室温：1822℃，相对湿度：4070％

[0096] 4 .剂量分组及受试样品给予方式：设阴性对照组、试验样品低剂量组、试验样品中剂量组、试验样品高剂量组，每组15只动物。

[0097] 根据人口服推荐用量，试验样品低剂量组、中剂量组、高剂量组分别为人体推荐量的10倍、20倍和30倍。对应的小鼠计量分别为0 .08g/kg、0 .16g/kg、0 .24g/kg。分别称取试验样品适量，加蒸馏水混匀；按0 .2mL/10g的体积给予相应剂量组动物灌胃。阴性对照组给予等体积蒸馏水。每天灌胃一次，实验周期为 30天。

[0098] 5 .肠道菌群检测：在给予受试样品之前，无菌采取小鼠粪便0 .1g，10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上(表2)。培养后以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算出每克湿便中的菌数(公式：CFU/g标本＝X/0 .1×稀释倍数/ 0 .1g，X为菌落数) ，取对数后进行统计处理。分别在给药14天和给药30天之后24h，与实验前同样方式取直肠粪便，检测肠道菌群，方法同上，比较不同时间灌胃对肠道菌群的影响。

[0099] 表2检测菌种与培养基

[0100]

[0101] 比较实验前后自身及组间双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌的变化情况，实验组实验前后自身比较差异有显著性，或实验后试验组与对照组组间比较有显著性、且试验组实验前后自身比较差异有显著性，符合以下任一项，可以判定受试样品的动物实验结果呈阳性。

[0102] ①粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气英膜梭菌减少或不增加，肠杆菌、肠球菌无明显变化。

[0103] ②粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气英膜梭菌减少或不增加，肠杆菌和/或肠球菌明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌/乳杆菌增加的幅度。

[0104] 表3植物乳杆菌360调节小鼠肠道菌群作用(lg cfu/g)

[0105

[0106]

[0107] 注释：*与对照组比较，*表示p<0 .05，**表示p＜0 .01

[0108] #与实验前比较，#表示p<0 .05，##表示p＜0 .01

[0109] 实验结果见表3。给予受试样品14天后，双歧杆菌大剂量组与对照组比较，双歧杆菌数量增多，差异明显，有统计学意义(P＜0 .05) ；双歧杆菌大剂量组实验前后比较差异明显，有统计学意义(P＜0 .05)。给予受试样品30天后，双歧杆菌大剂量组与对照组比较，双歧杆菌数量增多，有显著性差异(P＜0 .01) ；大剂量组实验前后比较有显著性差异(P＜0 .01)。实验结果符合粪便中双歧杆菌和 /或乳杆菌明显增加，产气荚膜梭菌减少或不增加。肠杆菌小剂量组与中剂量组，实验前后比较有统计学意义(P＜0 .05) ，肠杆菌大剂量组实验前后比较有显著性差异(P＜0 .01)。乳球菌小剂量组实验前后比较有显著性差异(P＜0.01) ，乳球菌中剂量组与大剂量组实验前后比较有统计学意义(P＜0 .05)。实验结果说明本发明的植物乳杆菌360促进肠道肠杆菌、乳球菌、双歧杆菌的增长，其中，双歧杆菌数量增多有显著性差异，因此植物乳杆菌360具有调节肠道菌群功能。

[0110] 应用实施例1

[0111] 本应用实施例公开了制备含有植物乳杆菌360膳食补充剂的片剂，具体为：

[0112] 分别称取乳糖30重量份、淀粉18 .3重量份、微晶纤维素5重量份、麦芽糊精 10重量份，葡萄糖10重量份混合均匀，采用浓度为30％酒精湿法20目筛网制粒成湿颗粒，55℃烘干 3 .5小时，20目筛网整粒后，添加360菌粉(≥300亿CFU/g)25 .7 重量份、硬脂酸镁1重量份混合均匀，旋转式压片机压片后，得到本发明的活性植物乳杆菌360膳食补充剂的片剂。

[0113] 应用实施例2

[0114] 本应用实施例公开了制备含有植物乳杆菌360的功能固体饮料，具体为：

[0115] 分别称取植物乳杆菌360菌粉(≥300亿CFU/g)26重量份、山梨糖醇31 .89 重量份、低聚半乳糖12重量份、低聚木糖8重量份、维生素C 0 .6重量份、三氯蔗糖0 .01重量份、DL苹果酸0 .5重量份，过40目筛网后，混合均匀，使用螺杆背封包装机装袋制成2g/袋益生菌功能固体饮料。[0116] 最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；也就是说，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。